01 연구개발 배경과 과제
1.1 MK-0616의 신약 개발 배경
Enlicitide Decanoate(MK-0616으로도 알려짐)는 저밀도 지질단백질 콜레스테롤(LDL-C)을 감소시키고 죽상동맥경화성 심혈관 질환을 치료하기 위해 고안된 최초의 완전히 새롭게 설계된 경구용 거대고리 펩타이드 PCSK9 억제제입니다.
위 그림에서 볼 수 있듯이 이 분야의 대표적인 예로는 MK-0616 외에도 항생제 반코마이신(2), 화학요법제 파클리탁셀(3), 항암제 에리불린(4) 등이 있습니다. 화합물 2와 3의 복잡한 구조는 실제 합성이 여전히 천연물을 기반으로 하는 반합성 방법에 의존한다는 것을 의미합니다. 대조적으로, Eisai 팀은 60개 이상의 단계를 통해 화합물 4의 전체 합성을 달성하여 폴리케타이드 화합물 합성에 획기적인 이정표를 세웠습니다.
MK-0616의 화학 구조는 매우 독특합니다. 이는 (천연 소스에서 파생된 것이 아니라) 처음부터 완전히 설계된 최초의 분자입니다. 또한 종양학이나 항감염제 용도가 아닌 심혈관 질환 치료를 위한 일일 경구용 PCSK9 억제제로서 전 세계적으로 수요가 기존 혁신 약물의 수요를 훨씬 초과하므로 수백 킬로그램에서 수 톤에 이르는 규모의 생산이 필요합니다.
1.2 종합적인 과제와 전략
MK-0616의 분자적 복잡성으로 인해 공정 개발에 대한 엄격한 요구 사항이 적용됩니다.
구조적 특징: MK-0616은 mRNA 디스플레이 기술 스크리닝을 통해 확인된 거대고리 펩타이드에서 유래했지만, 아래 그림과 같이 6개의 비표준 아미노산(총 8개 아미노산 단위), 37원 거대고리, 암모늄염 측쇄(10) 및 비펩타이드 단편(13)을 포함하고 있어 기존의 고체상 펩타이드 합성 기술이 완전히 효과가 없습니다.
해결해야 할 핵심 과제
1、극성 중간체의 안정성(특히 전체 공정에서 반대이온을 제어해야 하는 암모늄염 조각의 경우)；
2、대형 링 폐쇄의 선택성(10개 블록 중에서 조립 순서 최적화 필요)；
3、확장 문제(크로마토그래피 정제 방지, 밀리그램에서 킬로그램 규모의 처리량 보장)；
그러므로, 연구진이 제안한 주요 결정은 다음과 같습니다：
1、분할 정복："북부 단편"(위치 5, 6 및 7에서 비표준 아미노산으로 구성된 17원 고리)의 구성에 우선 순위를 부여하고 역합성 분석을 통해 거대고리 절단 전략을 단순화합니다(예: 위치 5와 8 사이의 아미드 결합 선택).
2、터미널 사이드 체인 소개：극성 암모늄염 조각(10)은 중간 정제와 관련된 문제를 피하기 위해 최종 설치 단계에 보관되어야 합니다.
3、산의 유연한 적용–염기 중화 반응(RCM)：n-헥산으로 연결된 사슬이 7번 위치에 형성됨–13; 이 반응은 뛰어난 직교성을 나타내며 여러 단계로 수행될 수 있습니다.
이러한 일련의 전략을 통해 연구자들은 궁극적으로 확장 가능한 합성 경로를 확립하여 임상 평가의 길을 열었습니다.02
02 합성 전략 및 최적화
연구진은 분석 연구를 통해 주요 거대고리 단편(Northern 단편)의 다단계, 다세대 최적화를 수행하고 최종 생성물과 Southern 단편의 조립을 최적화했습니다.
2.1 북부 부문의 다세대 최적화:
1세대– 37번의 반복
비표준 아미노산(예: 3-하이드록시프롤린)의 합성은 비효율적인 고리화 반응에 의존하기 때문에 효율성이 낮습니다.—Dieckmann 응축과 같은—키랄 분해능뿐만 아니라; 또한 이 프로세스에는 아래 그림에 설명된 것처럼 여러 차례의 보호 그룹 조작과 여러 크로마토그래피 정제가 필요합니다.
이러한 모든 요인은 표적 단편의 대규모 합성을 제한합니다.
2세대 동기식 시스템
생체촉매를 통해 획기적인 발전이 이루어졌습니다. 케톤 환원(KRED)의 도입으로 매우 효율적이고 입체선택적인 환원이 가능해졌습니다.β-히드록시에스테르; 또한, 조작된 TrpB 효소를 활용하여 불소화 트립토판을 합성함으로써 키랄 분리가 필요하지 않게 되었습니다. 그 결과, 아래 그림과 같이 합성단계 수가 줄어들고, 보호기 사용도 최소화되었다.
Northern 단편의 최적화를 위한 이 합성 경로는 임상 개발에도 적용되었습니다. 그러나 구조적 전략에서 발생하는 기회로 인해 단편 합성 경로의 추가 최적화가 필요해졌습니다.
첫째, 세 가지 후기 단계 결정화 중간체에 관한 주요 발견은 순도 제어에 중요한 포인트를 제공합니다. 따라서 이 세 가지 중간체를 차단하려면 합성 경로를 수정하는 것이 필수적입니다.
둘째, 올레핀의 고리삼량체화 반응은 합성 과정 중 가능한 한 늦게 수행하는 것이 좋습니다. 이 접근법은 루테늄 촉매가 벤조티우라민 생산의 전체 비용을 증가시킬 수 있다는 고려 사항에 기초합니다. 따라서 합성 경로의 마지막 단계에서 이 반응을 수행하면 비용을 크게 줄일 수 있습니다.
따라서 이는 3세대 접근 방식의 최적화를 촉진했습니다.
3세대 공통 스테핑 시스템
효소적 수산화반응을 통해 L-프롤린은 입체선택성이 99:1을 초과하는 3-히드록시프롤린으로 직접 산화됩니다. 크로마토그래피 정제를 피할 수 있는 벤젠술폰산염의 결정성과 같은 핵심 중간체가 확인되었습니다. 아래 그림과 같이 아미노산 결합 순서 조정 및 보호 그룹 전략 단순화와 함께 모듈식 어셈블리가 사용되었습니다.
3세대 합성 MK-0616 노던 단편은 이전 두 세대에서 합성된 단편과 다르다. 이러한 선택은 트레오닌 아미노산 잔기가 결여된 결정성 펜타노에이트 91(추후 합성 중에 통합됨)의 식별에 의해 이루어졌습니다. 이 염은 높은 수율과 순도로 분리할 수 있으며 합성 공정 전반에 걸쳐 핵심 중간체로 저장할 수 있는 매우 안정적인 중간체를 제공합니다.
3세대 최적화를 통해 새롭게 설계된 노던 프래그먼트(91)의 분리는 이제 14단계만 거치면 됩니다.—1세대 합성에 필요한 단계 수의 1/3에 불과합니다. 또한 3세대 프로토콜에서는 가장 긴 선형 시퀀스가 20단계에서 9단계로 절반 이상 감소했다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
2.2 남부 단편의 최적화
15단계로 구성된 1세대
상업적 공급업체로부터 대량으로 조달된 원자재를 시작으로 9단계 공정은 아래 그림과 같이 가장 긴 선형 시퀀스를 나타냅니다.
2세대 동기식 시스템
2세대 합성에서 개선된 점은 아래의 도식과 같이 단계수보다는 전체적인 효율과 순도 조절이 개선된 점이다. 수천 번의 시도 끝에 릴라민 염(99)이라는 서던 블롯 조각이 확인되었습니다.
이 두 화합물의 사용은 이전에 카르복실산에 대한 비키랄 용매 역할을 하는 것으로 입증되었습니다. 결과적으로, 결정질 염(99)은 놀랍게도 고순도 물질로 얻어질 수 있으며, 이에 따라 이전 세대의 합성에 필요한 광범위한 제조 HPLC 작업을 피할 수 있습니다.
2.3 최종 제품 조립
아래 그림에 표시된 대로 1세대 노던 단편과 서던 단편의 두 번째 중간체 모두 쉽게 보호되어 선형 전구체 61을 생성할 수 있습니다. 그러나 시클로올레핀 복분해 생성물의 수율은 매우 낮습니다.
그럼에도 불구하고, 연구원들은 아래 계획에 설명된 것처럼 MK-0616의 첫 번째 확장 가능한 합성을 가능하게 하는 또 다른 시퀀스를 성공적으로 사용했습니다.
1세대 엔알데히드 염은 고수율 아미드화와 SFC 정제를 통해 분자 코어에 측쇄를 설치하는 것으로 시작하는 63단계 공정을 통해 합성되었습니다. 이들 단계 중에서 단계 28은 가장 긴 선형 시퀀스를 나타냅니다.
2세대 최종 제품 조합은 아래 그림과 같습니다.
목표 생성물을 표적으로 하는 북부 및 남부 단편 모두에 대한 경로를 최적화함으로써 두 접근 방식 모두 평면 단편 결정질 중간체를 활용하여 합성의 최종 단계로 진행할 수 있습니다.
이 커플링 반응은 미정제 반응을 사용하여 다음 단계로 직접 진행할 수 있을 정도로 충분히 깨끗합니다.
전체적으로 MK-0616의 2세대 합성 경로에는 43단계가 필요하며, 그 중 21단계가 가장 긴 선형 시퀀스를 구성합니다. 이 시퀀스는 1세대 프로세스에 비해 총 단계 수와 가장 긴 선형 시퀀스의 길이를 1/3로 줄입니다.
03 핵심 기술 혁신
전체 최적화 프로세스를 분석하면 다음과 같은 핵심 기술의 여러 혁신이 드러납니다.
1、생체촉매 기술:KRED 동적 운동 분해능; 트립토판 유사체의 TrpB 효소 매개 합성; 프롤린 수산화효소를 통한 수산기의 직접 도입; 등.
2. 결정화 기반 정제: 여러 중간 단계—노던 블롯 단편의 메틸설포네이트 또는 서던 블롯 단편의 릴라민 염과 같은—결정화 정제를 위해 사용되므로 크로마토그래피 컬럼이 필요하지 않습니다.
3. 직교 보호 그룹 전략: Boc 및 Nosyl과 같은 보호기 간의 유연한 전환으로 다단계 반응의 선택성을 보장합니다.
4. 친환경 화학 고려사항: 중금속 촉매(예: 루테늄 촉매)의 사용을 줄이고 RCM 반응을 후기 단계로 전환하여 생산 비용을 낮춥니다.
04 요약 및 전망
이 논문은 결정화 공정의 중추적인 역할을 강조하고 모듈식 설계 접근 방식을 채택하면서 생촉매와 화학 합성의 유연한 통합을 보여줍니다. 이를 통해 실험실 탐사에서 산업 규모 생산에 이르는 체계적인 방법론을 보여줍니다. 이 연구는 복잡한 분자 합성 분야의 모범 사례를 나타냅니다. 총 단계 수는 1세대 프로토콜의 63단계에서 2세대 프로토콜의 43단계로 감소했으며 수율은 거의 1,000배 증가했으며 톤 규모 생산의 타당성이 가능해졌습니다. 전체 공정 전반에 걸쳐 결정화 단계에 전략적 중점을 두어 크로마토그래피 정제를 방지합니다. 이는 톤 규모 생산에 매우 적합한 기능입니다. 더욱이, 이 연구는 다른 복잡한 거대고리 펩타이드에 대한 합성 접근법을 위한 기술적 템플릿을 제공합니다.
