생체촉매 캐스케이드를 통해 거대고리 펩타이드 Enlicitide의 제조 가능

MSD의 시험용 경구용 PCSK9 억제제인 ​​엔리시타이드 데카노에이트(MK-0616)는 인간에서 실질적인 LDL-C 저하를 입증한 최초의 경구용 거대고리 펩타이드 PCSK9 억제제입니다. Enlicitide는 단환식 펩타이드의 mRNA 디스플레이 화면에서 개발되었으며 이후 비펩타이드성 가교를 통해 안정화되어 3개의 융합된 거대고리로 구성된 구조를 생성했습니다. 이 복합 옥타펩타이드는 12개의 아미드 결합과 중앙의 6개 탄소 사슬 링커로 연결된 6개의 비천연 아미노산과 2개의 단백질 생성 아미노산을 포함합니다. 전통적인 화학 합성에는 43단계, 보호기 조작(합성 단계의 거의 절반), 크로마토그래피 정제 및 고도로 희석된 루테늄 촉매 고리 폐쇄 복분해 단계가 필요하므로 확장성과 지속 가능성이 제한됩니다.

화학효소 제조 개발

MSD 과학자들은 에스테라제 및 이민 환원효소를 사용하는 생체촉매 펩타이드 단편 결찰 및 거대고리화와 결합된 아미노산 리가제에 의한 단량체의 직접 결합을 통해 가능해진 엔리시타이드 데카노에이트(1)를 제조하기 위한 간결하고 수렴적인 화학효소적 공정을 개발했습니다.

주요 성과

ATP 파악 리가제를 사용한 3개 효소 캐스케이드 어셈블리

- 3개 효소 캐스케이드(2개의 가공된 ATP 파악 리가제 + ATP 재활용)는 보호되지 않은 아미노산에서 테트라펩타이드를 조립합니다. ATP-포착 리가제(구체적으로 ATP 의존성 아미노산 리가제, AAL)는 ATP를 에너지원으로 사용하여 보호되지 않은 아미노산 또는 펩타이드 사이의 아미드 결합 형성을 촉매하는 효소입니다. 이들 메커니즘은 혼합 무수물 중간체를 통해 진행되며, 이는 친핵성 아민이나 활성화된 아실 공여체에 대한 보호 그룹이 필요 없이 직접 결합을 가능하게 합니다. 이 연구에서 연구자들은 비피도박테리움 청소년(BaAAL)의 ATP-grasp ligase와 조작된 변종(Trp-BaAALEng 및 Phe-BaAALEng)을 사용하여 원팟 캐스케이드에서 두 개의 비천연 아미노산(트립토판 및 페닐알라닌 유사체)이 포함된 디펩티드를 선택적으로 확장했습니다. 이러한 리가제는 단일 아미노산을 친전자체(C-말단 기질)로 받아들이지만 N-친핵체로서 더 긴 펩타이드를 수용할 수 있는 좁고 매립된 친전자체 포켓을 가지고 있습니다. 이러한 선택성은 C-말단에서 N-말단까지 순차적이고 보호기가 없는 펩타이드 조립에 이상적입니다. 소비된 ATP는 인산염 공여체로서 저렴한 헥사메타인산염과 함께 폴리인산염 키나제(FbPPKWT)를 사용하여 재활용됩니다.

조작된 에스테라제(RsEstEng) 위치선택적 마크로락탐화

- 조작된 에스테라제(RsEstEng)는 위치선택적 마크로락탐화를 촉매하여 노던 단편(73% 수율, 52kg 규모)을 형성합니다. RsEstEng는 Roseibacillus sp.에서 확인된 야생형 카르복실에스테라제(RsEst)에서 파생됩니다. 그 기본 기능은 에스테르 결합의 가수분해입니다. 연구진은 방향성 진화를 통해 이를 엔리시타이드의 노던 단편(4) 합성에서 위치선택적 마크로락탐화(대환식 아미드 결합의 형성)를 위한 촉매로 전환했습니다. 이는 선형 테트라펩타이드(9)의 안정하고 부피가 큰 tert-부틸 에스테르를 아실 공여체로 받아들여 거대고리 펩타이드(4)를 생성하여 분자 내 아미드 결합을 형성합니다. 이는 이전 효소 캐스케이드의 높은 이온 강도 조건 하에서도 검출 가능한 올리고머가 없고 단지 0.8% 에스테르 가수분해 부산물로 선택적 고리화를 달성했습니다.

조작된 티오에스테라제(BlTEEng) 분자간 결찰

- 가공된 티오에스테라제(BlTEEng)는 에피머화 없이 북부(4) 및 동부 단편(3)의 분자간 결찰을 수행합니다. BlTEEng는 Brevibacillus laterosporus(BlTE)의 비리보솜 펩타이드 합성효소(NRPS)에서 원래 절단된 티오에스테라제(TE) 도메인의 변형된 버전입니다. NRPS 시스템의 야생형 티오에스테라제는 일반적으로 티오에스테르 결합을 통해 담체 단백질로부터 선형 펩티드의 거대고리화 또는 방출을 촉매합니다. BlTE의 조작된 변이체는 일부 활성을 나타내었지만 이량체 부산물을 선호했습니다. 효소 공학은 가수분해에 불안정한 천연 티오에스테르 대신에 보다 안정적인 이소프로필 옥소에스테르를 사용하여 분자간 결찰을 촉매하도록 효소를 전환했습니다.

4개 효소 계단식 환원성 아미노화 거대고리화

- 4개 효소 캐스케이드(PsIREDEng, KsKREDEng 및 보조인자 재활용 효소 StLDHWT, TvADHWT)는 환원성 아민화 거대고리화를 달성하여 이환식 디아민을 형성합니다(69% 수율, 46kg 규모). KsKREDEng는 Kyrpidia sp.의 가공된 케토레덕타제입니다. 이는 벤질 알코올 화합물(10)이 NAD+에 의존하는 일시적인 알데히드(11)로 산화되는 것을 촉매합니다. PsIRED는 Pseudogymnoascus sp.의 이민 환원효소입니다. NADPH에 의존합니다. PsIREDEng는 알데히드(11)와 기존 아민의 환원성 아민화를 촉매하여 고리형 이민(12)을 형성한 후 2차 아민 거대고리(13)로 환원합니다. StLDHWT는 피루브산을 젖산으로 환원시켜 산화 단계에서 NAD+를 재생성하는 반면, TvADHWT는 이소프로판올을 아세톤으로 산화시켜 환원 단계에서 NADPH를 재생합니다.

조작된 PBP 티오에스테라제를 통한 최종 거대고리화

- 웨스턴 단편(2)과 뒤이은 조작된 페니실린 결합 단백질 티오에스테라제(SsPBP-TEEng)와의 화학적 결합은 고농도(70g/L)에서 최종 거대고리를 닫아 일반적인 희석 한계(기존 합성에서는 5g/L)를 극복합니다. 전체 프로세스에는 3단계 캐스케이드 단계, 7개 조작 + 3개 보조 효소, 39% 전체 수율, 멀티킬로그램 규모 시연, >99% 순도, 크로마토그래피 없음, 보호 그룹 없음이 포함됩니다. 이 연구는 복잡한 거대고리 펩타이드 제조를 위한 지속 가능하고 확장 가능한 청사진을 제공하여 단계 수와 낭비를 획기적으로 줄이면서 효율성과 환자 접근성을 향상시킵니다.